Gene Expression Analysis Center
C2 基因表現分析中心
Gene Expression Analysis Center
實驗室主持人：林奇宏
協同主持人：宋晏仁／范明基
壹、背景資料
一、設置緣由
人類基因體定序工作預計將於公元2003年完成，屆時，人們面對的挑戰將是如何分析這（十）數萬個基因的表現及 其功能，故功能性基因體研究
(Functional Genomic Study) 將是下一個世紀生物醫學的重點，本核心設施將針對 功能性基因體研究，規劃設置相關之軟硬體設備。本中心規劃從各個不同技術層面分析細胞或組織之轉錄體（transcriptome），我們的特色為：集中發展（從不同層面，以不同技術分析基因表現），採用最新科技（包含開發及引進新技術），人材培訓及技術推廣（舉辦相關工作研習會）。
二、核心技術簡介
圖1：微陣列分析之操作流程
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Gene Expression Analysis Center
為了研究基因在細胞或組織中之表現，本中心將與人腦探索卓越計畫合作，設立微陣列（MicroArray）分析系統，利用DNA雜交反應（Hybridization）及螢光，呈色反應或放射性偵測等方式，平行處理大量的基因數據來比較不同組織間或比較生理及病理變化時基因 群組表現之差異（請見圖1）。人腦探索卓越計畫將規劃設置以微點觸 （Microspotting）為主的微陣列系統，而本中心將在初期架設 微陣列螢光掃描儀，以供資料讀取。（註：可適用於大部分市場提供之螢光型微陣列玻片）
2. Gene Subtraction Studies
A modified version of the subtractive hybridization method originally designed
by Clontech Laboratories, Inc. (PNAS 93: 6025-6030, 1996) will be used to isolate
differentially expressed genes in particular cell types or tissues. Two sets
of RNA derived from different cells or tissues are needed as starting materials.
It is a PCR-based cDNA subtraction method, which could selectively amplify target
cDNA fragments (unique genes) and simultaneously suppress nontarget DNA amplification.
In addition, this method includes a hybridization step that normalizes sequence
abundance during the course of subtraction by standard hybridization kinetics,
therefore overcomes the problem of low abundance of target genes. The PCR fragments
thus generated are cloned into a TA vector (Invitrogen) to make libraries. Clones
that contain inserts are selected for sequencing and sequence information is
analyzed through gene database searching and comparison (the latter two need
to use C1 Sequencing Core and C3 Bioinfomatics Core)
This service is temporarily removed from the service list in the year 2001.
3. Serial Analysis of
Gene expression
Serial Analysis of gene expression(SAGE)是公認Transcriptome profiling 最佳方法之一。SAGE技術由Dr.
Kinzler 在1995發表(Science 270:484-487)，利用每條mRNA近三端的一段十個鹼基的序列為識別標記，代表一種基因，利用定序方式計算細胞內mRNA標記的種類及數量，快速,正確的分析細胞內所有基因的表現種類及量，本中心已於2000年完成SAGE技術的測試，並逐步建立各種組織及腫瘤的Transcirptome
profiling，以尋找各種生理狀況下基因表現的特異性，以及可能之致病基因，作為後續研究的依據。
4. Protein Trap and Visual Screening
This present service aims to systemically collect the information regarding
intracellular distributions of gene products in a high throughput manner. The
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standard protocols is first to collect (or to construct) an expression
library, to fuse the coding sequences with either green fluorescence protein
(GFP) or FLAG tags, and to express the tagged gene products in a polarized hepatic
cell model for subsequent localization tasks by an automatic visual screen system.
The resulting protein sub-cellular distribution information will be integrated
with the existing bio-informatic database (containing sequence and expression
profile data of the human genome which are maintained and updated by Yang-Ming
Genome Research Center, YMGC), providing crucial clues for functional annotation
of the expressed genes, especially those bearing no know biological activities
(such as EST clones). Genes showing intracellular distribution patterns of interest
can then be further characterized. Antibody probes will be made, for example,
to confirm the localization of native proteins, and for other cell/tissue biology
experiments.
5. Localization and functional studies
Various microscopy
From conventional transmission light microscopy (bright field, dark field, phase,
contrast, DIC or Normaski), fluorescence microscopy, to video-enhanced time-lapsed
microscopy are all available. Specific focuses are on various live cell microscopy,
including calcium and various vital tracking, organelle labeling, and various
GFP and related tagging methodologies (Paddock, 1999; Cullander, 1999) and protein
tagging methodologies (such as green fluorescence proteins, GFPs, and their
derivatives, for review, see Tsien, 1998; Ellenberg and Lippincott-Schwartz,
1999).
Confocal Microscopy
為配合分析相關基因產物之表現程度及細胞內之分佈與代謝之研究，我們於1996年購置共軛焦點顯微影像系統 (Leica TCS NT confocal microscope,
Leica Microsystems Heidelberg GmbH)，目前已累積近三千工作小時，提供校內校外相關技術與服務，成效良好。我們將配合「追求卓越」計劃，增購新一代共軛焦點顯微影像系統(Leica
SP2)，配置雙光子膜組(Two-Photon Module)，以增加訊號雜訊比及組織穿透深度，並安裝多重偵測光路，進一步提供各項顯微影像服務。
Functional assays:
Time-lapsed recording, calcium imaging, organelle tracing, various tagging methods,
and in vitro assays (such as in vitro motor activity). Contact us for more details
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三、服務相關之研究發展
本中心尤其著重於分析基因表現之相關方法學，SAGE技術測試已於2000完成，並開始建立有關肝正常與病理組織之資料庫，同時著手MicroSAGE的技術測試，降低SAGE樣品需求限制。並將與台北榮總及本校蛋白體學研究人員合作，於最短時間內成立二維蛋白質電泳分析之標準操作步驟，以納入本中心之服務。而利用各類型顯微操作從事之活細胞與組織的功能性研究更是本中心的特色之一，如胞器動態攝影(organelle
vital dye tracing)、鈣離子攝影(calcium imaging)、綠色螢光蛋白質標記(green fluorescence protein
tracing)、紅外線雷射光鉗(laser tweezers)等，相關研發及合作請洽本中心。
貳、設施規劃與說明
儀器／空間／人員：
1. MicroArray Scanning
儀器：2000年三月已裝設一組 GSI GENETAC 2000 （此儀器一次最多可放置24片玻片）及Axon玻片掃描儀。
空間：實驗大樓B309室。
人員：目前由一位技術員兼任。預定聘請一位專任技術員。
2. Gene subtraction study
本服務於2001年暫由常規服務項目中移除，詳情請洽本中心。
3. Localization and functional studies
目前由林奇宏老師實驗室負責發展，位於實驗大樓四樓B309室，擁有操作相關實驗之各項儀器，將聘任一位研究助理負責。
4. Protein Trap and Visual Screening
目前由林奇宏老師實驗室負責發展，預計於2001年秋天提供服務。
5. Localization and functional studies
Confocal Microscopy:
本服務目前由解剖及細胞生物研究所宋宴仁及王懷詩老師負責，位於實驗大樓，主要儀器為共軛焦顯微系統。
Live Cell Microscopy:
本服務目前由林奇宏老師實驗室提供，位於傳統醫學乙棟大樓微免所，主要儀器為各式顯微影像及數位影像系統，將聘任一位研究助理負責基本操作。
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參、常規服務
1.MicroArray Scanning 微陣列玻片掃描
申請人應提供之材料
1.欲掃描之玻片，玻片上請加以編號。
2.所使用之螢光名稱、矩陣範圍、矩陣示意圖、陽性對照組位置及相關資料（將提供表格供參考）。
3. Zip 100磁片一至數片（formatted for PC），視所掃描範圍及玻片數而定。
服務原則
1. 以目前之人力，本中心將提供一次三小時，每週三次的服務（待專任人員到職後每週可增至八次服務）。
2.服務對象以追求卓越計畫之參與研究室為第一優先，所有玻片將由本中心代為掃描。若被服務者有額外需求，可派遣一位專人前來本中心受訓，以裨自行進行掃描工作。
3.非追求卓越計畫之單位，亦可申請掃描服務，惟服務次數以一個月四次為上限。若需服務次數頻繁，本中心將負責訓練該單位之專人一員，以協助掃描工作之執行。
申請人預期得到之服務成果
1.三組掃描影像，包括一組自動曝光，二組調整曝光之結果。
2.螢光強度示意圖（需申請者告知所感興趣的區域；此圖並非資料分析結果，乃是粗略的訊號強弱比較）。
操作所需時間
1.單次服務以三小時為上限，應可掃描24至48片玻片。
2.實際所需時間依訊號強弱會有調整。
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資料分析
掃描資料之進一步分析，將以collaboration方式進行。
預估使用經費
每小時酌收服務費150元
連絡人及連絡方法
董建億：2826-7000轉5561
申請方法及規定
申請人請於要求服務前三天與負責人聯絡，以便排定服務執行時間。急件至晚需於前一日下班前連繫，恕不接受當日服務之要求。
技術訓練及推廣活動
視實際需要將彈性舉行儀器操作訓練及分析軟體應用之講習。以上之各項規定將視實際執行狀況加以修正。申請人若有任何意見也請立即反應給負責人員，以利改進。
2. Gene Subtraction Study
本服務於2001年暫由常規服務項目中移除，詳情請洽本中心。
3. Serial Analysis of Gene Expression
預計於2001年秋天提供服務。
4. Protein Trap and Visual Screening
預計於2001年秋天提供服務。
5. Localization and Functional Studies
申請人應提供之材料與資訊
1. 欲從事細胞或組織內定位之蛋白質或分子名稱及其他相關資訊。
2. 利用免疫螢光染色或其他螢光染劑完成固定、染色等步驟之標本 (請使用本中心提供之標準操作程序)。
3. 每單次服務以不超過六個標本(載玻片)為原則。
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申請人預期得到之服務成果
1. 蛋白質或分子於細胞或組織內之分佈及相對分佈量。
2. 影像圖檔可以不同數位格式(TIFF、PICT等)儲存或傳送。
3. 本中心亦提供基礎分析軟體。
操作所需時間
請務必預約，每單次服務將於三工作天內完成。
預估使用經費
每單次服務之基本收費為NTD 1,000
若為合作計畫則無每單次服務
影像輸出收費
各式磁碟片(1.44 MB Floppy, 230MB MO)
及光碟片(PD, DVD-RAM) 請自備
B/W 600dpi laser printer (A4) NTD 5/print
Color laser 600dpi laser printer (A4) NTD 20/print
Color laser 600dpi laser printer (A3) NTD 50/print
Photo-print paper additional NTD 40/print
Color dye-sublimation NTD 150/print
目前服務能量
每週可從事三天（周二、三、四）預約服務
系列實驗工作請事先與本中心連絡，以利安排。
非常規服務之合作研究
活細胞影像
Time-lapsed recording
Vital dye/GFP-tag living cell microscopy
Calcium imaging
Laser tweezers
Micorinjection, etc.
負責教授
解剖及細胞生物學研究所 宋宴仁／王懷詩
Phone: 2826-7160/-7035; Email: yjsung@ym.edu.tw/hswang@ym.edu.tw
微生物及免疫學研究所 林奇宏
Phone：2826-7219； Email：linch@ym.edu.tw
連絡人及連絡方法
解剖及細胞生物學研究所 余玉英小姐／蔡淑芬小姐
Phone: 28267000 ext 5235
技術訓練及推廣活動
每學年第二學期開課｛影像技術在生命科學研究之應用｝
不定期開辦工作研討會(Workshop)及相關技術訓練課程。
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