L12 斑馬魚遺傳實驗室
Zebrafish Genetics Laboratory
實驗室主持人：蔡惠珍
協同主持人：黃銓珍
壹、背景資料
一、設置緣由
基因計畫在陽明大學已執行數年，並在多種癌組織中篩選了接近4,000種具異常表現的基因。雖然體外培養的細胞能在蛋白質的功能上提供部分的訊息，但動物模式才是蛋白質在活體內發揮功能的完整模式。目前小鼠是哺乳動物中最理想的實驗動物，但其體內受精，體內發育的特性令許多胚胎早期即需發揮功能的蛋白質在gain of function及loss of function的情況下無法順利的著床發育。而斑馬魚的胚胎發育上的機制與哺乳動物是非常相似，許多重要的調控蛋白質的表現位置與時間也都與哺乳動物相似，由於斑馬魚胚胎數量極多，體外授精體外孵化且胚體完全透明，神經、肌肉、心臟、血管、血球在可見光顯微鏡清晰清楚。受精卵單細胞在48到72小時後即發育成可覓食逃亡的魚體。精子可經由NEU chemical mutagenesis進行突變種的篩選。單細胞受精卵可施打DNA、RNA並密切追蹤後續的影響，因此斑馬魚已成為研究癌症、心血管疾病、器官發育、脊椎動物胚胎發育、神經發育、細胞凋亡的重要模式，在藥物毒性的篩檢也扮演重要角色。
二、核心技術簡介
1、DNA顯微注射
將100~200 ng/2 pl的linearlized DNA注射單細胞受精卵的細胞質中，進行啟動子調控機制之研究或短期大量表達未知功能基因以in vivo的方式研究其可能功能。由於受精卵體積碩大因此在解剖顯微鏡下注射DNA到受精卵的動作可以快速進行，以300~400個施打過DNA胚胎的phenotype來代表注射DNA的功能是具有相當高可信度。
2、RNA顯微注射
試管合成的mRNA (with 5端CAP及3端poly A) 的完備結構可直接注射到斑馬魚的受精卵卵黃的部分，再經由卵黃與細胞物質互換的程序將mRNA均勻的分布於多細胞的胚胎。mRNA轉譯成蛋白質後即可發揮功能，可於胚胎的發育過程中觀察其功能。由於mRNA幾乎可遍佈魚體所有組織，具有快速篩檢蛋白質未知功能的優點。
3、Antisense morpholino oligomer顯微注射
除了大量表現正常蛋白質或突變蛋白質外，另一種程度性Knock-down基因表現的方法是藉由化學性相當穩定的antisense morpholino oligomer來達成。只要依據ATG上游下游各10個核酸序列合成oligomer，即可借由注射量的控制達到程度性地影響標的蛋白質生成量，進而引發不程度性干擾重要蛋白質的目的，在胚胎發育過程中避免嚴重干擾重要蛋白質引起的致命性。
4、基因轉殖魚stable line的建立
基因轉殖魚提供一個穩定表現蛋白質並可重覆使用的動物模式，由於adeno associated virus ITR序列可增加chromosome
insertion的機率至20%，提高建立stable line的機率，由於班馬魚代與代之間僅需3個月，因此這是一個快速建立實驗動物模式的方法。
5、NEU point mutagenesis
NEU的濃度控制影響突變種的品質，控制NEU在理想的範圍可產生每個基因single point
mutation的突變種，由於斑馬魚快速發育成熟的特性，NEU的突變方法可以用來篩選令研究者感興趣phenotype的突變種。
三、空間
顯微注射設備放置在護理館大樓211室，養魚魚房設在210室，長3.5米寬2.5米，配置四個五層高不銹鋼架魚缸，採開放滴流的水流打氣循環系統，具備光週期、28℃恆溫、24小時供水設施。
四、人員
第一年兼任研究助理一名負責斑馬魚排卵，維護魚房清潔。本實驗由中央研究院生化研究所黃銓珍副研究員協同主持。
貳、設施規劃與說明
一、現有儀器
油壓式顯微注射器
Leica解剖顯微鏡
溫控光週期培養箱
二、預計擴充之設備
第一年
1、設置魚房，架設開放式水流及打氣系統
2、Zeiss正立式顯微鏡 (Axioplan 2)
3、顯微鏡螢光設備一組
4、氣壓式顯微注射器
第二年
1、拉針器
2、磨針器
3、攝影系統及分析軟體一套
(AxioCam, Axioversion)
參、常規服務
一、DNA質體顯微注射
大量表現蛋白質於特定組織中，借由神經、心臟、肝、皮膚等特異性組織特異性之啟動子，啟動未知功能蛋白質於上述器官中表現，以斑馬魚作in vivo的功能性研究，利用魚體透明的特性可經由可見光顯微鏡即可獲得初步大量篩選的結果，申請者應提供之材料是建構好的真核表現蛋白質體。各種restriction enzyme切割確定之結果資料，及DNA sequencing確認質體正確性。備製linearized targeting vector (約20μg)，及photograph證明linearized targeting vector之品質與定量。有關啟動子的研究，斑馬魚實驗室將提供載體予申請者進行以水母綠色螢光蛋白質的表現來代表啟動子的功能。
二、RNA顯微注射
在胚胎發育過程中，卵黃與細胞質存有快速互換分子的管道，利用mRNA直接注射我們可達成全身性觀察蛋白功能的效果，合適進行in vitro transcription DNA載體將由本斑馬魚實驗室提供，申請者應以DNA restriction enzyme切過的線性DNA質體模板，合成in vitro transcription轉錄成mRNA，完成mRNA的定量及電泳照相。
三、Antisense morpholino oligomer注射
Morpholino在斑馬魚應用的成功率相當高，針對ATG附近的序列合成antisense，以顯微技術打進單細胞，即可in vivo觀察此特定基因被不同程度性knock down的後續phenotype。申請人應提供由專業公司評估建議合成的oligomer 10 μg。
申請人預期得到的服務
1、提供CMV enhancer及皮膚、心臟、肝臟、神經特異性啟動子驅動的質體，以利置入研究者有興趣蛋白的cDNA，除了CMV enhancer，Keratine-8皮膚啟動子之外使用其他組織特異性啟動子 (如BMP4, Nav1.6等啟動子) 需與事先取供提供該啟動子之實驗室同意。
2、提供in vitro transcription所需質體內含SP6, T3, 及T7 RNA聚合酵素結合序列。
3、提供DNA and RNA transient
overexpression及morpholino knock-down的基因轉殖魚。
班馬魚實驗室將完成300-400個受精卵的注射，24-48小時後並會同申請者使用厚片組織專用的Axioplan 2顯微鏡進行可見光的觀察，若需以螢光免疫染色進行細部分析，斑馬魚實驗室亦提供厚片組織專用的螢光顯微鏡。
四、預估使用經費
服務所需費用請參考: http://genome.ym.edu.tw
五、服務能量
第一年顯微注射50個基因
六、非常規服務之合作研究
非外觀發育可觀察到的效果，需藉由進一步雜交染色法尋找phenotype者，需視個別基因功能設定可能的phenotype進一步研究者請與主持人會商。
七、負責教授
陽明大學神研所 蔡惠珍副教授
中央研究院生化所 黃銓珍副研究員
八、聯絡與聯絡方法
陽明大學神研所 蔡惠珍副教授
Tel：02-2826-7154；Fax：02-2820-0259；e-mail：hjtsay@ym.edu.tw
九、技術訓練與推廣活動
每年支援及參加陽明基因體研究中心所舉辦的研討會。
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Last update: Oct 7, 2003